What's the advantage of using 454 sequencing?

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I have heard about 454 sequencing, which seemed to be very powerful. Why was that?

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454這家公司的定序技術，能夠讓一部454的定序機器，去除準備sample的時間後，在四小時中定序出 2.5*10^(7) bases (ref. 1, 2)，若是以人類基因體 3.1*10^(9) bases 來算，則約21天可以定序完成。

粗略的定序步驟是先將genome sample用restriction enzymes 切碎 (ref. 1, 2)，個別的DNA fragments接上adapters之後，使adapters接上bead，並調整condition使每一個bead只接上一條DNA fragment，將含有PCR (polymerase chain reaction)所需材料與酵素的膠質液體包住bead，使一小drop的液體中只有一個bead以確保進行PCR時不會有其他的DNA fragments，PCR完成之後，將這些具有約1*10^(7) DNA fragment copies的beads分別放入光纖材質的slice的凹槽中，一張6.4平方公分的slice有1.6*10^(6)個凹槽，一個凹槽僅能存放一個 bead，然後開始做pyrophosphate-based sequencing，又稱為pyrosequencing (ref. 3)，是利用dNTP接上延長中的DNA序列之後放出的PPi(pyrophosphate)產生ATP，再用此ATP的能量來發光，在slice的另一側，裝設有CCD (charge coupled device)偵測光的強弱，序列的資料是已經經過處理之後存放於Linux-base的系統中，並且內附軟體以供分析。

454 sequencing除了相當適合應用於genome scale的定序以及所有原本的PCR應用之外，還能用於ultra deep PCR這項新領域(ref. 4, 5)，亦非常有機會取代目前micorarray所提供的服務。以往的PCR方式是用primer抓取想要的基因，再對這些來自各個不同細胞的相同基因作 PCR，因此若這一千個不同細胞的同一個基因有一個有點突變，則無法定序出來，因為定序結果是這一千個基因綜合的結果，但是454的技術是在各個不同的 bead上僅有一條序列，而且bead與bead之間在做PCR時並不會互相污染，因此能夠偵測出這種極少量的突變，這種研究方式被稱為ultra deep PCR。由於如此快速的定序速度，又能夠不需要與待測的未知序列配對的primer，因此很有可能會取代microarray的地位。

但是這種新技術在目前也是有使用的限制與缺點(ref. 1, 2)，其一是當相同的base連續出現很多次時，較有可能出現數目上的錯誤，其二，因為每個DNA fragment約是在100 bases長，因此當小片段的序列重複出現時，容易有無法與其他序列接合的情形。

如果對454的產品有興趣，可以到Roche (ref. 6)的網站訂購，目前除了第一款Genome Sequencer 20 System之外，功能較強的新版已經上市，叫做Genome Sequencer FLX System，每一個DNA fragment支援到200到300個base，定序的準確度也有所提升，但是並沒有公開價錢。

Reference:
1. Nature. 2005 Sep 15;437(7057):376-80. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors
2. Nature. 2005 Sep 15;437(7057):326-7. Massively parallel sequencing
3. Principle of Pyrosequencing Technology. http://www.pyrosequencing.com/DynPage.aspx?id=7454
4. http://en.wikipedia.org/wiki/454_Sequencing
5. http://www.454.com/news-events/abstract.asp?id=54
6. https://www.roche-applied-science.com/s ... /index.jsp